滅菌

滅菌是指用物理或化學方法將所有致病和非致病的微生物全部殺死。滅菌法是指殺滅或除去所有微生物的繁殖體和芽孢或孢子的技術。微生物包括細菌、真菌、病毒等。微生物的種類不同、則滅菌方法不同，滅菌效果也不同。細菌的芽孢具有較強的抗熱能力，因此滅菌效果，常以殺滅芽孢為準。消毒是指殺滅物體上的微生物的繁殖體，不能保證殺死芽孢或孢子。滅菌與消毒在藥品生產過程中是極為重要的，它是藥品生產過程中一項重要的操作，也是保證藥品質量的重要措施之一。
滅菌涉及到廠房、設備、容器、潔具、工作服裝、原輔材料、成品、包裝材料，儀器等等的滅菌。無菌藥品特別是注射液、供角膜創(chuàng)傷或手術用滴眼劑等無菌制劑是直接進入人體血液循環(huán)系統而產生療效的藥品，所以對其質量有特殊要求，它必須符合藥典無菌檢查的要求。為此，在生產過程中，要努力消除微生物的污染，殺滅藥品中的微生物，這就是滅菌要達到的目的。
滅菌的方法基本上分為二大類：物理方法（干熱滅菌、濕熱滅菌、射線滅菌、濾過滅菌）和化學方法（氣體滅菌、藥液滅菌）。下面將分別介紹幾種常用的滅菌方法。
第一節(jié)  干熱滅菌法及其設備
一、干熱滅菌
干熱可用于能耐受較高溫度，卻不宜被蒸汽穿透，或者易被濕熱破壞的物品的滅菌。同時干熱也是制藥工業(yè)中用于除熱原的方法之一。由于在相同的溫度下，干熱對微生物的殺滅效果遠低于飽和蒸汽，故干熱滅菌需要較高的溫度或較長的滅菌時間。
凡用濕熱滅菌法無效的非水性物質或極粘稠的液體如甘油、液狀石蠟、油類等可用本法滅菌。滅菌時，油類、軟膏基質或粉末應鋪成不超過0.6cm的薄層，使熱更好的透入。
評價干熱法滅菌的相對滅菌能力時，一般可采用相似于Fo值的致死率單位和生物指示劑。Fo值與濕熱滅菌系統驗證中使有的Fo值的不同點是：評價干熱滅菌過程的相對滅菌能力的Fo值是將時間與溫度條件的改變折算成170℃時的相當時間，同時設定Z值為20℃即FH值。BP1993年版規(guī)定，僅以滅菌為最終目的干熱滅菌系統，必須保證其最小的FH值大于170℃   60min。對于采用干熱存活概率法滅菌的系統，驗證結果應能證明其滅菌過程保證對耐熱微生物的殺滅效果達到認可的低存活概率，一般未被殺滅的概率為10~6，即滅菌物品經過滅菌后殘存微生物污染的可能性為百萬分之一。對于采用干熱過度殺滅法滅菌系統的驗證結果，應證明其滅菌過程保證對干熱呈高度耐受性的微生物產生大于12個log的遞減，取得低于10~12的微生物存活概率，即滅菌物品經過滅菌后殘存的微生物污染可能性低于百萬分之一，同時在做過度殺滅法滅菌過程驗證時不需要做常規(guī)的帶菌量的估價。
二、干熱滅菌的主要設備
干熱滅菌的主要設備有干熱滅菌柜、隧道滅菌系統。干熱滅菌設備一般由下列幾個重要部分組成：
1、加熱器——它是干熱滅菌設備的主要組成部分，對滅菌效果的好壞影響極大。加熱器故障是造成干熱滅菌設備滅菌效果下降的主要原因之一，其主要表現為升溫速度下降；影響熱分布；產生塵埃物質。而造成加熱器故障的原因主要是加熱器的長期使用或通過加熱器的空氣質量較差所致。所以一般應在滅菌器的加熱系統配置電流監(jiān)測器，以及時發(fā)現其故障。
2、高效過濾器——在干熱滅菌設備中，進風應通過高效過濾器；除去內部空氣循環(huán)系統中產生的塵埃物質需要高效過濾器，防止排風倒流的污染也可裝高效過濾器。所以高效過濾器必須滿足干熱滅菌工藝用風量的要求，并能承受相應的風壓。
3、緩沖板、風閥、氣流調節(jié)器或空氣檔板——緩沖板或空氣檔板用于控制干熱滅菌器的空氣流量，多安裝于進風或排風風管或加熱器附近，用于正壓控制。氣流調節(jié)器可以安裝排風系統中的防止倒流風污染的高效過濾器附近，通過控制排風量控制正壓，也可以用氣流調節(jié)器控制進風和排風風量以保持正壓。一般情況下，干熱滅菌器腔室內的壓力略高于其相臨的非無菌區(qū)而略低于其相臨的無菌區(qū)。
4、風機——對干熱滅菌器中的氣流循環(huán)影響很大，風機的風量應該可以測量，并可調整，必要時可以要求供應商將此項要求增加到其設備標準中，因為風機風量的測量指示值，可以為設備使用過程中檢查風機狀態(tài)提供依據。
5、傳送帶（僅適用于連續(xù)法）——傳送帶的速度，在連續(xù)傳送干熱滅菌系統中是十分重要的滅菌效果影響因素。目前大多數干熱連續(xù)法滅菌系統中已設有傳送帶速度控制器，但較少有速度記錄裝置。由于傳送帶速度決定了物料經過滅菌器時所接受的熱量，所以其速度記錄是證明滅菌器在控制狀態(tài)下運行的基本資料之一，生產工藝中亦有必要保存每次滅菌過程的傳送帶速度的記錄。同時干熱滅菌器的SOP，也應明確規(guī)定各種滅菌過程傳送帶的運行速度范圍，此運行速度范圍應是經過驗證確定的。
6、運行連鎖控制系統——干熱滅菌器中連鎖控制系統設有：門連鎖控制系統；壓力傳感器；溫度傳感、控制、停止傳送帶運行的連鎖控制裝置等，以保證在任何情況下出現溫度低于設計要求時防止滅菌物品在低于滅菌溫度的情況下通過滅菌器。
7、溫度控制器及記錄儀——在干熱滅菌系統中，溫度探測、傳感、控制、記錄系統是整個滅菌過程控制的基礎，其控制系統必須能保證滅菌器腔室內滅菌溫度可以保持在設定的滅菌溫度范圍內，其記錄系統必須將溫度探測、傳感系統的溫度讀數準確無誤地記錄清楚。
第二節(jié)  濕熱滅菌法及其設備
一、濕熱滅菌法
是在飽和蒸汽或沸水或流通蒸汽中進行滅菌的方法。由于蒸汽潛熱大，穿透力強，容易使蛋白質變性或凝固，所以滅菌效率比干熱滅菌法高。這是注射劑生產中應用廣泛的一種滅菌方法，它具有滅菌可靠，操作方便，易于控制和經濟等優(yōu)點。但不適用于對濕熱不穩(wěn)定的藥物的滅菌。
影響濕熱滅菌的因素有：
1、細菌的種類與數量：不同細菌，同一細菌的不同發(fā)育階段對熱的抵抗力有所不同。細菌數越少，滅菌時間越短，如注射劑中即使細菌全部殺死，而注射液中的細菌尸體過多，也會引起臨床上的不良反應。
2、藥物性質與滅菌時間：一般來說，滅菌溫度越高滅菌時間越短，但考慮到藥物的穩(wěn)定性，應在達到有效滅菌的前題下可適當降低滅菌溫度或縮短滅菌時間。如維生素C注射液用流通蒸汽15分鐘滅菌，Nacl輸液115℃30分鐘滅菌。
3、蒸汽的性質：蒸汽有飽和蒸汽，濕飽和蒸汽和過熱蒸汽。飽和蒸汽熱含量較高，熱穿透力較大，因此滅菌效力高。濕飽和蒸汽帶有水分，熱含量較低，穿透力差，滅菌效力較低。過熱蒸汽溫度高于飽和蒸汽，但穿透力差，滅菌效率低。
4、介質的性質：制劑中含有營養(yǎng)物質，如糖類、蛋白質等，增強細菌的抗熱性。細菌的生存能力也受介質PH值的影響。一般中性環(huán)境耐熱性最大，堿性次之，酸性不利于細菌發(fā)育。
二、濕熱滅菌法的主要設備
濕熱滅菌法的主要設備是滅菌釜，滅菌釜種類很多，性能差異也很大，但其基本結構大同小異，所用的材質為堅固的合金。現在國內很多企業(yè)使用的方型高壓滅菌釜，能密閉耐壓，有排氣口、安全閥、壓力和溫度指示裝置。帶有夾套的滅菌柜備有帶軌道的格車，分為若干格。滅菌柜頂部裝有壓力表二只，一只指示蒸汽夾套內的壓力，另一只指示柜室內的壓力，兩壓力表中間為溫度計。滅菌柜的上方還應安裝排氣閥，以便開始通入加熱蒸汽時排除不凝性氣體。近年來，有些制藥企業(yè)已經開始采用具有抽真空能力及Fo控制的蒸汽滅菌釜，目前國內采用的進口滅菌釜主要有二種：一種以蒸汽為滅菌介質的旋轉式滅菌釜，如奧地利的HDRR009.20/IS，另一種以過熱水作介質的噴淋式滅菌釜，如意大利FEDEGARI公司的FOW5—500。進口滅菌釜的主要優(yōu)點是批次量較大，溫度控制系統準確度及精密度較好，產品滅菌過程中受熱比較均勻。
滅菌釜的基本滅菌程序為：
裝瓶   →  升溫、進蒸汽置換空氣  →  滅菌  → 排汽→ 預熱水冷卻 →卸瓶。
三、脈動真空滅菌器使用的注意事項：
1、必須將滅菌器內的空氣排出。如果滅菌器內有空氣存在，則表上所表示的壓力是蒸汽和空氣二者的總壓而非單純的蒸汽壓力。結果壓力雖然達到預定水平，但溫度達不到。若表壓與溫度表指示不一致，則有可能空氣沒有排盡，也可能壓力表失靈，也可能是不飽和蒸汽，應找出原因加以解決。
2、滅菌時間必須由全部藥液真正達到所要求的溫度時算起，濕熱滅菌時的預熱時間（升溫時間）雖可較干熱時間的短，但測定和縮短預熱時間的重要性，也決不次于干熱滅菌。例如250ml —500ml玻瓶輸液，預熱時間一般為15~30分鐘，多者可達45分鐘。
3、滅菌完畢后，停止加熱，一般須使壓力表所指示的壓力逐漸下降到零后，才能放出鍋內蒸汽，使鍋內壓力與大氣壓相等后，稍稍打開滅菌鍋，待10~15分鐘后，再全部打開。這樣可避免內外壓力差太大而使物品沖出鍋外和使玻璃瓶爆裂。這點必須注意以免發(fā)生工傷事故。為了縮短滅菌周期，也有往滅菌器內盛裝有溶液的封閉容器噴霧冷卻水，加速冷卻。以水溫18℃，霧滴大小80μm的噴霧時的冷卻效果最大，過冷過粗的噴霧將引起瓶子的爆破。對于滅菌后要求干燥但又不易破損的物料，滅菌后立即放出滅菌器內蒸汽，以利干燥。
四、流通蒸汽滅菌法和煮沸滅菌法
流通蒸汽滅菌法是在不密閉的容器內，用蒸汽滅菌，壓力與大氣壓相等，即100℃的蒸汽滅菌。目前我國藥廠生產注射劑，特別是1~2ml的注射劑及不耐高溫的品種，基本上都采用此法，煮沸滅菌法就是把安瓿或其它物品放入水中煮沸滅菌。流通蒸汽滅菌與煮沸滅菌，一般是100℃30分鐘至60分鐘。此法不能保證殺滅所有芽孢，例如破傷風桿菌等厭氧性細菌的芽孢，故制備過程中要盡可能避免污染?？捎脽釅簻缇鏖_啟排汽閥進行滅菌。在農村或野戰(zhàn)條件下亦可采用蒸籠來滅菌，若在高原地區(qū)，由于水的沸點降低，因此在水中常加入1~2%碳酸鈉，5%苯酚等以提高水的沸點；但也有用延長滅菌時間的方法來解決的。一般每升高300公尺，延長滅菌時間20%。此法對增殖型微生物的滅菌效果大，但不能保證殺滅芽孢。
五、低溫間歇滅菌法
此法是將待滅菌的制品，用60~80℃加熱1小時，將其中的細菌繁殖體殺死，然后在室溫或孵卵箱中放置24小時其中芽孢發(fā)育成繁殖體，再第二次滅菌。連續(xù)操作三次以上，至全部芽孢消滅凈為止。此法適用于必須用熱法滅菌但又不耐較高溫度的制劑或藥品。缺點是時間長，消滅芽孢的效果不夠完全。應用本法滅菌的制劑或藥品，除本身具有抑菌力者外，須加適量抑菌劑，以增加滅菌效力。
以上幾種滅菌方法為濕熱滅菌法的幾種滅菌方式，本廠現采用熱壓滅菌法和煮沸滅菌法，如口服液車間采用對藥液采用煮沸滅菌40分鐘，對C型瓶、瓶蓋采用121℃20分鐘或105℃30分鐘滅菌，如果口服液采用最終滅菌時，灌封完成的藥品在規(guī)定時間內采用105℃30分鐘滅菌。
第三節(jié)  其他滅菌方法及消毒方法
一、輻射滅菌法
以放射性同位素（60C0或137Cs）放射的γ射線殺菌的方法。射線可使有機化合物的分子直接發(fā)生電離，產生破壞正常代謝的自由基，導致微生物體內的分子化合物分解。輻射滅菌的特點是不升高滅菌產品的溫度，穿透性強，適合于不耐熱藥物的滅菌，醫(yī)療器械、高分子材料、包裝材料等滅菌。滅菌劑量一般可用2.5×104GY(戈瑞)。此法已為《英國藥典》（1998），《日本藥局方》十三版所載。我國有些企業(yè)亦有用60C0對某些中藥和醫(yī)療器械進行滅菌。輻射滅菌，制備費用高，對某些藥品可能產生藥效降低，產生毒性物質或發(fā)熱物質，使用輻射滅菌還應注意安全防護措施。
二、紫外線滅菌法
是指用紫外線照射殺滅微生物的方法。一般用于滅菌的紫外線波長是200~300nm，滅菌力最強的波長是253.7nm。紫外線作用于核酸蛋白促使其變性，同時空氣受紫外線照射后產生微量臭氧，從而起共同殺菌作用。紫外線進行直線傳播，可被不同的表面反射，穿透力微弱，但較易穿透清潔空氣及純凈的水。因此本法適用于照射物體表面之滅菌、無菌室的空氣及水的滅菌；不適用于藥液的滅菌、固體物質深部的滅菌；普通玻璃可吸收紫外線，因此裝于玻璃容器中的藥物不能用此法滅菌。紫外線對人體照射過久，會發(fā)生結膜炎，紅斑及皮膚燒灼等現象，故一般在人入室前開啟紫外線燈1~2小時，關閉后人才進入潔凈室。如果必須在人進去后仍要開紫外線滅菌，則人的皮膚及眼睛應有有效的防護措施。一般在6~15m3的空間可裝置30瓦紫外線燈一盞，離地面2.5~3m為宜。
用紫外線照射滅菌時要注意下列問題：
1、紫外線的殺菌力，隨使用時間增加而減退，一般使用時間達到額定時間70%時應更換紫外線燈管，以保證殺菌效果。國產紫外線燈平均壽命一般為2000h。
2、紫外線的殺菌作用隨菌種不同而不同，殺霉菌的照射量要比殺桿菌大40~50倍。
3、紫外線照射通常按相對濕度為60%的基礎設計，室內濕度增加時，照射量應相應增加。
4、紫外線滅菌效果與照射的時間長短有關，這需要通過驗證來確定照射時間。
5、紫外照射燈的安裝形式及高度，應根據實際情況,參考使用說明決定。
三、環(huán)氧乙烷滅菌法
環(huán)氧乙烷滅菌法是利用環(huán)氧乙烷氣體進行殺菌的方法。它是一種傳統的滅菌方法，可應用于工衣滅菌、不耐加熱滅菌的藥品、醫(yī)用器具、設施、設備等的滅菌。環(huán)氧乙烷滅菌系統，主要有下列四項互相制約的重要因素影響滅菌效果：
1、溫度；
2、濕度；
3、氣體濃度；
4、滅菌時間。
因為環(huán)氧乙烷是易燃易爆物質，明火可以引起燃燒，同時由于氣體分解還可能引起爆炸，環(huán)氧乙烷滅菌中應十分注意安全問題。
環(huán)氧乙烷具有非常強的滲透和擴散能力，其滅菌的機理主要是強氧化，因此具有殺菌譜廣，滅菌能力強的特點，對微生物的繁殖體、芽孢有較強的殺滅效果。雖然環(huán)氧乙烷在高濃度時有刺激性臭味和毒性，但屬中度毒性，一般可以很快揮發(fā)，不會在系統內表面殘留余毒。
滅菌機理主要是它的烷基的取代性質、細菌蛋白質分子中的-cooH、-NH2、- OH、SH基上的氫原子被環(huán)氧乙烷的羥乙基基團所取代而使菌體細胞的代謝產生不可逆性的破壞。
CH2-CH2 +R-SH→R-S-CH2-CH2OHo
        R-SH代表含巰基的蛋白分子。
用環(huán)氧乙烷氣體滅菌的程序，大致為將滅菌物品置于滅菌器內，減壓排除空氣，預熱，環(huán)氧乙烷氣體采用混合氣（一般環(huán)氧乙烷氣體含10-20%，二氧化碳含80~90%），在減壓下輸人混合氣體，保持一定濃度、溫度和濕度，經過一定時間后，抽真空排除環(huán)氧乙烷氣體，然后送入無菌空氣置換環(huán)氧乙烷氣體，直至換凈。
四、濾過滅菌法
濾過滅菌法是用濾過方法除去活的或死的微生物的方法，是一種機械除菌方法，這種機械叫除菌過濾器。主要用于對熱不穩(wěn)定的藥物溶液、氣體、水的除菌。供滅菌用的濾器，要求能有效地從溶液中除凈微生物，溶液順暢地由濾器通過，濾液中不落入任何不需要的物質，濾器容易清洗，操作簡便。
繁殖型細菌很少有小于1μm的，芽胞大小為0.5μum或更小些。所以，對于以過篩作用濾過的濾器，例如纖維素酯膜濾器，其孔徑大小必須小到足以阻止細菌和芽孢進入濾孔之內，孔徑約為0.2μm?？孔枇粲诳椎纼然蜢o電作用的濾器孔徑可稍大于所要濾除的顆粒，但壓力過大或波動，顆粒就有被擠過的可能。通常用測定孔徑的方法，是用大小為0.7μm左右的靈菌（B.prodigilsus）混懸液濾過，濾液通過培養(yǎng)實驗，觀察有無靈菌生長。常用除菌濾器有微孔薄膜器，摺疊式纖維素濾棒，一般選用孔徑0.22μm。濾過法應配合無菌操作技術，并必須對成品進行無菌檢查，以保證其除菌質量。濾膜以CH2-CH2滅菌為宜。                                      O
五、臭氧消毒法
臭氧（O3）的消毒原理是：臭氧在常溫、常壓下分子結構不穩(wěn)定，很快自行分解成氧（O2）和單個氧原子（O），后者具有很強的活性，對細菌有極強的氧化作用，臭氧氧化分解了細菌內部氧化葡萄糖所必須的酶，從而破壞其細胞膜，將其殺死。多余的氧原子則會自行重新結合成為普遍氧分子（O2），不存在任何有害殘留物，故稱為無污染消毒劑。它不但對種種細菌（包括肝炎病毒、大腸桿菌、綠膿桿菌及雜菌等）有極強的殺滅能力，而且對霉菌也很有效。
生產臭氧的原料主要是電能和空氣，一般通過高頻臭 氧發(fā)生器（電子消毒器）來獲得，消毒時，直接將臭氧發(fā)生器置于房間中間即可。
臭氧消毒效果的驗證中需確認和校正的臭氧發(fā)生器技術指標有：臭氧產量、臭氧濃度和時間定時器，并通過驗證檢查細菌數來確定消毒時間。
六、甲醛消毒方法
1、計算房間體積，按10g/m3的比例稱出甲醛。
2、將甲醛倒入甲醛發(fā)生器或加熱盤或燒杯中，并放好加濕用水，必要時還需加入高錳酸鉀（2~3g/m3），然后加熱（甲醛發(fā)生器用蒸汽加熱，加熱盤或燒杯用熱水盛入其中加熱）使其蒸發(fā)成氣體。
3、滅菌流程：空調器停止運轉→ 啟動甲醛氣體發(fā)生器或在加熱盤中加熱甲醛  →讓甲醛氣體擴散約30分鐘→ 啟動空調器讓甲醛氣體循環(huán)約30分鐘 →停止空調器，房間熏蒸消毒，時間不少于8小時 → 房間排氣，用新鮮空氣置換約2小時→ 恢復正常運行。
當相對濕度在65%以上，溫度在24~40℃時，甲醛氣體的消毒效果好。
甲醛消毒滅菌的氣體發(fā)生量、熏蒸時間、換氣時間等應以驗證結果來最后確定。也有報導過氧乙酸用于車間的室內滅菌，效力比相同濃度的甲醛大兩倍半，對粘膜無刺激性，對木、金屬制品、醫(yī)療器械無影響。
七、消毒劑消毒
潔凈室的墻面、天花板、門窗、機器設備、儀器、操作臺、車、桌、椅等表面以及人體雙手（手套）在環(huán)境驗證及日常生產時，應定期清潔并用消毒劑噴灑，常見的消毒劑有異丙醇（75%）、乙醇（75%）、戊二醛（1%）、新潔而滅（0.1~0.2%）等。亦可用0.5~3%石碳酸或2~5%的甲苯酚。
無菌室用的消毒劑必須在層流工作臺中，用0.22μm的濾膜過濾后方能使用。
第四節(jié)滅菌管理要點
一、選用濾過器材和處理方法應符合工藝要求，微孔濾膜使用前后應作完整性試驗，以保證其滅菌效果。
二、藥液從配制到滅菌開始，其間隔不得超過工藝規(guī)定的時間。
三、滅菌應有溫度、壓力及升溫時間、恒溫時間、數量及全過程的溫度壓力曲線圖或溫度曲線圖。
四、按批號進行滅菌，不得混批。滅菌前后的中間產品應有可靠的防混措施。
五、滅菌設備使用前都必須進行驗證，工藝改變或大修后，要進行再驗證，以確保滅菌效果。
六、滅菌釜宜選擇雙扉式的滅菌釜，使用前應進行溫度均勻性和滅菌效果的驗證，并有記錄，FO值應控制在8.0以上。
七、直接接觸藥品的包裝材料、設備和其他物品的從滅菌到使用時間間隔應有規(guī)定。
八、當一個批號產品使用多個滅菌柜滅菌時，應加亞批號。
第五節(jié)蒸汽滅菌釜驗證
蒸氣滅菌釜驗證，一般的驗證步驟如下：
一、驗證方案的制訂；
二、驗證方案的批準；
三、儀表及文件的準備；
四、預確認；
五、安裝確認——電氣安裝、蒸汽安裝、冷支卻水安裝；
六、運行確認——單機或系統試車。
七、性能確認——熱分布測試、熱穿透性試驗、生物指示劑驗證試驗、微生物孢子的挑戰(zhàn)性試驗。
八、驗證報告——數據分析、驗證結果、評價和建議。
九、批準結論。
蒸汽滅菌釜驗證如何進行，原國家醫(yī)藥管理局批準GMP、GSP委員會編寫《藥品生產驗證指南》（1996年4月出版）P263附錄四"滅菌釜驗證示例"可供參考。