滅菌工藝的開發(fā)和驗(yàn)證

1， 兩種滅菌方法
　　蒸汽-濕熱滅菌工藝開發(fā)和應(yīng)用，可采用兩種方法：過度殺滅法（the overkill method）和生物負(fù)載法（the bioburden method）。生物負(fù)載法也可稱為存活概率法。
 
1.1 過度殺滅法
　　工業(yè)上蒸汽滅菌周期的設(shè)定和應(yīng)用，一般使用過度殺滅法（the overkill method）。使用過度殺滅法的目標(biāo)是確保達(dá)到一定程度的無菌保證，而不管裝載物的實(shí)際負(fù)載生物的數(shù)量多少和抗熱性如何。假定生物負(fù)載的數(shù)量和耐熱值設(shè)為如下水平：
N0＝106
D121＝1分鐘
Z＝10℃
　　為了達(dá)到無菌保證水平SAL小于10-6，NF＝10-6，利用上面這些數(shù)值，可以計(jì)算出為達(dá)到致死率所需的FPHY和FBIO如下：
F0＝D121×（LogN0－Log NF）＝12分鐘
　　很少發(fā)現(xiàn)自然生成的微生物擁有超過0.5分鐘的D121值。過度殺滅法假設(shè)的生物負(fù)載數(shù)量和抵抗力都要高于實(shí)際。大多數(shù)微生物的耐熱性都要比這低，因此能夠提供很高程度的無菌保證。
　　即便采用蒸汽-濕熱滅菌工藝為過度殺滅法（the overkill method），仍然需要對(duì)被滅菌產(chǎn)品的初始菌進(jìn)行周期監(jiān)測(cè)，并定期采用生物指示劑測(cè)試。
 
1.2 生物負(fù)載法
　　通常來說不耐熱產(chǎn)品或物品的滅菌就不能使用過度殺滅法了。這就需要我們所建立的滅菌周期必須能恰當(dāng)?shù)貧缥⑸镓?fù)載，但是不能導(dǎo)致不可接受的產(chǎn)品分解。這樣的滅菌周期的建立就有賴于研究產(chǎn)品上的微生物數(shù)量和耐熱能力。一旦微生物負(fù)載的數(shù)量和耐熱能力得以明確，就可以設(shè)計(jì)出一個(gè)能達(dá)到SAL小于10-6的滅菌周期。
　　按CGMP規(guī)范生產(chǎn)的產(chǎn)品實(shí)際生物負(fù)載數(shù)量應(yīng)該是很低的，每個(gè)包裝約在1～100CFU，對(duì)產(chǎn)品給予80～100℃下10～15分鐘熱休克，可以殺滅耐熱值低的微生物。例如：
產(chǎn)品的生物負(fù)載測(cè)試中，測(cè)得：
N0＝102
D121＝1分鐘
Z＝10℃
　　則達(dá)到無菌保證水平SAL小于10-6，NF＝10-6，利用上面這些數(shù)值，可以計(jì)算出為達(dá)到致死率所需的FPHY和FBIO如下：
F0＝D121×（LogN0－Log NF）＝8分鐘
　　生物負(fù)載法需有實(shí)測(cè)產(chǎn)品活菌計(jì)數(shù)和耐熱性篩選程序。必須取得足夠的有關(guān)生物負(fù)載數(shù)據(jù)，亦建立歷史資料。對(duì)生物負(fù)載篩選次數(shù)的要求，取決于歷史資料的質(zhì)量和變化情況，被滅菌產(chǎn)品的種類、生產(chǎn)工藝和滅菌工藝的類型等等。若生產(chǎn)環(huán)境發(fā)生了變化，應(yīng)考慮對(duì)生物負(fù)載進(jìn)行補(bǔ)充監(jiān)測(cè)。
　　對(duì)生物負(fù)載耐熱性的測(cè)定，可將含生物負(fù)載產(chǎn)品樣本在推薦滅菌工藝下作分級(jí)遞增暴露時(shí)間處理，然后進(jìn)行無菌檢查試驗(yàn)，以測(cè)定在不同的暴露時(shí)間內(nèi)存活的菌量，或存在的陽性樣本比例。作為一種替代方法，生物負(fù)載微生物的耐熱性可通過分離和繁殖，隨后接種在產(chǎn)品上或適當(dāng)載體上進(jìn)行測(cè)定。不過，要注意繁殖會(huì)改變生物負(fù)載的抗性。此外，還應(yīng)對(duì)常規(guī)生物負(fù)載的微生物耐熱性進(jìn)行測(cè)定。
　　就生物負(fù)載而論，具有濕熱高度耐熱性的微生物菌株有：生胞梭菌（Clostridium sporogenes），凝結(jié)芽孢桿菌（Becillus coagulans），枯草芽孢桿菌和嗜熱芽孢桿菌等。
　　以生物負(fù)載法為依據(jù)的滅菌工藝，需經(jīng)常進(jìn)行微生物篩選，以測(cè)定與產(chǎn)品有關(guān)的生物負(fù)載數(shù)量和種類。在常規(guī)生產(chǎn)中，應(yīng)從每一種生產(chǎn)設(shè)備中抽取具有代表性的產(chǎn)品樣本，并設(shè)計(jì)生物負(fù)載監(jiān)測(cè)程序，對(duì)產(chǎn)品部件及生產(chǎn)中，包括環(huán)境和生產(chǎn)過程中，任何可明顯地影響生物負(fù)載地變化進(jìn)行評(píng)定。
 
2， 用于注射劑生產(chǎn)的輔助物料的滅菌工藝
　　用于注射劑生產(chǎn)的部分輔助物料在生產(chǎn)過程中與藥品直接接觸，因此同樣需要滅菌。它們包括：過濾器、膠塞、膠管、服裝、不銹鋼器皿、填充機(jī)械部件、清潔用品等等。一般通過與飽和蒸汽直接接觸而實(shí)現(xiàn)滅活，濕熱蒸汽的能量通過傳導(dǎo)或?qū)α髯饔脗鬟f熱量。常用方法是建立能夠提供相同的最小滅菌保證水平的標(biāo)準(zhǔn)周期，再加上一定的安全系數(shù)，不管裝載物的內(nèi)容是什么。
　　對(duì)于這類物品，獲得可重復(fù)和可預(yù)測(cè)無菌保證的最大障礙是物品中潛在的空氣，所以適合的滅菌過程是先采用預(yù)真空過程，然后飽和蒸汽滅菌的方法。預(yù)真空過程的效果明顯優(yōu)于重力置換過程。
　　對(duì)于預(yù)真空滅菌程序，滅菌過程開始之前對(duì)裝載物的處理是很重要的。如果每次的真空度為0.1個(gè)大氣壓，那么每個(gè)脈沖將使滅菌器內(nèi)的空氣減少90％或者1個(gè)對(duì)數(shù)單位?？梢栽黾訛槿齻€(gè)真空脈沖（蒸汽注入高于大氣壓，以避免空氣進(jìn)入滅菌腔室），使裝載物處于正常狀態(tài)。通過這個(gè)方法，空氣去除的效率會(huì)提高，平衡時(shí)間會(huì)縮短。
　　典型的重力置換程序建立在如下的理論基礎(chǔ)上：腔室中的冷空氣重于進(jìn)入的蒸汽并且將沉降到腔室的底部。蒸汽進(jìn)入腔室的時(shí)候，空氣和冷凝液一起從腔室底部的蒸汽疏水閥排出。去除空氣過程的成功取決于對(duì)蒸汽疏水閥的準(zhǔn)確操作和合適的蒸汽分布。蒸汽一般通過導(dǎo)流板或多孔管注入滅菌器腔室，如果蒸汽增加得過于迅速或者沒有合理分布，裝載物的頂部附近可能會(huì)產(chǎn)生氣穴，如果蒸汽增加得過于緩慢，空氣可能會(huì)被加熱而混入蒸汽中，從而使空氣去除更加困難。重力置換去除空氣的效率低于其他方法，不推薦用于空氣去除困難的物品。
　　對(duì)于多孔/堅(jiān)硬物品的滅菌，需要確定以下操作參數(shù)（但不僅限于此）：
滅菌程序階段 對(duì)參數(shù)的說明
滅菌程序全部 外殼溫度/壓力 外殼溫度不能超過或者明顯低于滅菌器腔室的滅菌溫度。要控制溫度避免過度加熱或過度冷卻。
監(jiān)控探頭記錄探頭
 必須獨(dú)立，并帶有合適尺寸的記錄紙以便記錄滅菌程序全部的溫度壓力變化值
加熱階段
 真空脈沖的次數(shù)、范圍和持續(xù)時(shí)間（若使用）
 用于多孔堅(jiān)硬物品滅菌時(shí)的空氣去除
正壓力脈沖的次數(shù)、范圍和持續(xù)時(shí)間（若使用）
 用于在滅菌程序開始之前控制裝載物
腔室加熱
 對(duì)于飽和蒸汽的滅菌方法，可以根據(jù)溫度和壓力的變化設(shè)置報(bào)警點(diǎn)
滅菌階段
 滅菌時(shí)間
 對(duì)每個(gè)滅菌程序都是重要的控制參數(shù)
滅菌階段的溫度
 對(duì)每個(gè)滅菌程序都是重要的控制參數(shù)
滅菌階段的腔室溫度波動(dòng)
 對(duì)每個(gè)滅菌程序都是重要的控制參數(shù)
值的累積
 對(duì)于滅菌器自帶的測(cè)量探頭，最小值的記錄有利于滅菌程序的評(píng)價(jià)
冷卻階段
 干燥時(shí)間
 可以選擇加熱、真空等手段來干燥裝載物
真空解除速率
 若需要，可以用來保護(hù)包裝或過濾器的完整性
若最后采用噴淋水降溫，則必須監(jiān)控噴淋水的質(zhì)量。但是多孔/堅(jiān)硬物質(zhì)不適合采用噴淋水降溫，一般采用抽真空或夾套降溫。比如過濾器，膠塞，膠管，服裝，不銹鋼器皿，填充機(jī)械配件，清潔用品等等。
對(duì)于滅菌裝載方式，需要注意以下幾點(diǎn)：
 裝載物的類型和結(jié)構(gòu)要加以確認(rèn)并記錄在案；Ø
 裝載物不能接觸到滅菌艙室內(nèi)壁；Ø
 金屬箱表面與底座之間的接觸應(yīng)減小到最低程度，通常使用有孔的支架，必要時(shí)也可以用可調(diào)節(jié)的支架；Ø
 為了便于空氣去除，冷凝水排出和蒸汽穿透，要明確地確定裝載物地方位并記錄在案；Ø
 質(zhì)量大的裝載物應(yīng)放置在滅菌器中較低的架子上，以盡量減少被冷凝水弄濕；Ø
Ø控制滅菌器中物品的數(shù)量，如果裝載物的大小能夠改變，則需要確定最小和最大的裝載物，確認(rèn)中間裝載物的合理插入法應(yīng)包括最低負(fù)載中的最難滅菌物品；
 如果確認(rèn)研究表明物品的位置不影響滅菌效果，那么裝載的形式可能是可變的；Ø
 裝載記錄可以作為操作人員的參考。Ø
 
4， 滅菌驗(yàn)證的方法
　　滅菌過程的驗(yàn)證和常規(guī)控制的相關(guān)內(nèi)容包括滅菌設(shè)備的確認(rèn)、滅菌工藝的驗(yàn)證、包裝適用性、裝載試驗(yàn)、空氣過濾器的檢查、蒸汽的質(zhì)量及管理、真空檢查和再驗(yàn)證周期等等內(nèi)容。
4.1 在蒸汽滅菌驗(yàn)證進(jìn)行之前，需要確認(rèn)以下內(nèi)容：
　　蒸汽滅菌器制造商的質(zhì)量保證、
　　蒸汽滅菌器的檢查、安裝和性能確認(rèn)、
　　安裝于蒸汽滅菌器的空氣過濾器的泄漏試驗(yàn)、
　　空氣流速或流型試驗(yàn)（若必需）、
　　壓力或真空度測(cè)試、
　　蒸汽質(zhì)量測(cè)試（若必需）、
　　生物指示劑（化學(xué)指示劑）的挑戰(zhàn)性試驗(yàn)、
　　不同裝載的驗(yàn)證、
　　升溫時(shí)間的控制（若必需）、
　　保溫時(shí)間內(nèi)的溫度波動(dòng)范圍、
　　對(duì)滅菌器進(jìn)行熱分布/熱穿透測(cè)試儀器的校準(zhǔn)，
　　IQ/OQ/PQ的方案
　　具備證實(shí)能夠進(jìn)行IQ、OQ和PQ的所有內(nèi)容并能對(duì)偏差進(jìn)行處理及糾正的能力。
4.2 一般來說：驗(yàn)證（IQ/OQ/PQ）必須包含：
4.2.1被測(cè)滅菌設(shè)備和公用系統(tǒng)的測(cè)試必須包含：
1.1 滅菌設(shè)備供應(yīng)商的評(píng)價(jià)；
1.2 滅菌設(shè)備的容積、真空度、壓力以及泄漏率；
1.3 用什么作為滅菌介質(zhì)（如蒸汽、高壓空氣、過熱水等）并能證實(shí)有效；
1.4 滅菌設(shè)備如有夾層、夾層與氣室之間的壓力與溫度保持在什么水平上是安全的；
1.5 使用何種類型的過濾器？多長時(shí)間進(jìn)行挑戰(zhàn)性試驗(yàn)？
1.6 使用何種類型的監(jiān)測(cè)和控制傳感器？如何校正？是否符合相關(guān)規(guī)定？
1.7 如滅菌設(shè)備中裝有蒸汽分流器，則必須消除系統(tǒng)運(yùn)行安全的風(fēng)險(xiǎn)；
1.8 時(shí)間、溫度、壓力、壓力消減速率的控制（若必需）；
1.9 空氣質(zhì)量、水質(zhì)量的控制以及報(bào)警（若必需）；
1.10 以上所有情況的變化是否評(píng)價(jià)再驗(yàn)證的必要；
4.2.2 對(duì)滅菌工藝的驗(yàn)證必須包含：
2.1 空載熱分布研究
2.2 熱穿透研究
   每種裝載容器的每種裝載方式；
   每種方式的運(yùn)行次數(shù)；
   每種方式的冷點(diǎn)是否確定；
2.3 升溫、降溫速度對(duì)生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品的影響；
2.4 噴淋冷卻速度對(duì)被滅菌產(chǎn)品的影響；
2.5 冷卻用水是否能有效地控制微生物；
2.6 溫度測(cè)量系統(tǒng)是否提供每一個(gè)測(cè)點(diǎn)的打印數(shù)據(jù)；
2.7 溫度測(cè)量系統(tǒng)是否每次運(yùn)行都進(jìn)行前后校正；
2.8 溫度測(cè)量系統(tǒng)的校正是否符合相關(guān)規(guī)定；
2.9 生物指示劑的使用：
   類型；
   來源；
   密度和D值；
   是否采用生物負(fù)載法？是否測(cè)試被滅菌產(chǎn)品的初始菌？
   如發(fā)生意外（陽性），如何處理；
2.10 若出現(xiàn)熱穿透偏差如何處理；
2.11 若必需，提供污染菌（微生物負(fù)載）的特性及鑒別；微生物負(fù)載的報(bào)警及采取措施的限度；生物指示劑的鑒別、耐熱性及穩(wěn)定性；污染菌與生物指示劑耐熱性的比較；微生物挑戰(zhàn)性試驗(yàn)，用以證明在最短的滅菌周期內(nèi)在最差條件下（如產(chǎn)品處在生物指示劑最難殺滅的位置或它屬于最難滅菌的產(chǎn)品或二者兼?zhèn)涞那闆r）；
2.12 對(duì)過度殺滅的風(fēng)險(xiǎn)分析及管理；
2.13 滅菌后的干燥程序?qū)缇Ч挠绊懀?br /> 2.14研究產(chǎn)品耐受性變更導(dǎo)致的滅菌工藝變化；
2.15總體評(píng)價(jià)并指導(dǎo)很好滅菌效果的裝載量；
2.16 驗(yàn)證及其相關(guān)項(xiàng)目的培訓(xùn)
4.2.3 對(duì)于滅菌工藝的驗(yàn)證，應(yīng)符合以下規(guī)定：
1， 保溫時(shí)間內(nèi)溫度波動(dòng)應(yīng)在±0.5℃~±1.0℃之內(nèi)（環(huán)境溫度變化變化應(yīng)盡可能?。?；
2， 保溫時(shí)間內(nèi)壓力波動(dòng)應(yīng)在±5Kpa之內(nèi)（若必需）；
3， 滅菌工藝驗(yàn)證包含最小裝載、飽和裝載和典型裝載三種；或者采用最大裝載，最小裝載和混合裝載的兼容性研究；
4， 極限最低溫度與最大值相差不大于3K；
5， 等效滅菌時(shí)間的偏差不大于15s（對(duì)最大的滅菌設(shè)備不大于30s）；
6， 空氣過濾器的流速應(yīng)不大于0.13Kpa/min（若必需）；
7， 空氣移除速度的檢查（若必需，適合多孔/堅(jiān)硬物質(zhì)）；
8， 生物指示劑的布置；
9， 若必需，則需測(cè)被滅菌物品的初始菌（微生物負(fù)載）；
10， 以冷點(diǎn)為控制溫度；即確認(rèn)所有測(cè)點(diǎn)均達(dá)到滅菌溫度后才計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間。
 
5， 滅菌驗(yàn)證形成的相關(guān)文件
5．1 相關(guān)文件要點(diǎn)
　　以下是對(duì)蒸汽滅菌器或蒸汽-濕熱滅菌工藝的相關(guān)驗(yàn)證文件的分類，可以根據(jù)實(shí)際情況作出篩選，但必須評(píng)估相關(guān)內(nèi)容是否完整：
　　滅菌器制造商及其設(shè)備信息；
　　滅菌器的安裝報(bào)告；
　　首次滅菌的情況、所有操作及控制文件，包括儀表、閥門、報(bào)警裝置以及相關(guān)設(shè)施的校驗(yàn)等；
　　產(chǎn)品的安全耐受性研究報(bào)告
　　真空度以及壓力保障措施的驗(yàn)證
　　泄漏率測(cè)試報(bào)告
　　蒸汽、水、壓縮空氣等輔助系統(tǒng)的質(zhì)量測(cè)試報(bào)告
　　包含冷點(diǎn)、裝載分布、熱分布、熱穿透等項(xiàng)目研究的IQ、OQ、PQ方案及報(bào)告
　　對(duì)驗(yàn)證結(jié)果的總結(jié)和風(fēng)險(xiǎn)分析，提出裝載指導(dǎo)報(bào)告
　　完整的操作記錄（也可以是表格）
　　維護(hù)保養(yǎng)程序以及記錄，包含預(yù)防性維護(hù)、條件維護(hù)等內(nèi)容
　　任何變更、任何故障的處理報(bào)告
　　培訓(xùn)記錄以及效果評(píng)價(jià)報(bào)告
　　再驗(yàn)證周期的規(guī)定
　　其他
5．2 驗(yàn)證文件要點(diǎn)
　　滅菌參數(shù)與被滅菌物品特性的確認(rèn)
　　真空度（泄漏率）
　　蒸汽滅菌的初始菌控制（滅菌前物品的生物負(fù)荷的數(shù)量）
　　蒸汽滅菌中對(duì)于水、空氣過濾器等的要求
　　產(chǎn)品的安全耐受值
　　對(duì)過度殺滅的限制
　　挑戰(zhàn)試驗(yàn)
　　再驗(yàn)證周期
　　新的滅菌工藝的開發(fā)
　　驗(yàn)證實(shí)施步驟
　　偏差處理、風(fēng)險(xiǎn)分析以及驗(yàn)證報(bào)告