噴淋式滅菌柜的驗(yàn)證

實(shí)例1：
 
濕熱滅菌設(shè)備的溫度驗(yàn)證 
1溫度驗(yàn)證程序設(shè)計(jì)基本要求
    濕熱滅菌的基本程序設(shè)計(jì)基本要求源于US.FDA在上世紀(jì)70年代中期提出的，且在80年代施行的："關(guān)于大容量注射劑GMP技術(shù)性原則"五個(gè)方面要求：
    (1)在滅菌工序應(yīng)能確保產(chǎn)品達(dá)到F₀ ≥ 8；
    (2)滅菌前，待實(shí)驗(yàn)的容器中有最高帶菌量，污染菌應(yīng)具有最強(qiáng)的耐熱性；
    (3)每一個(gè)滅菌釜的每種裝載方式及每種規(guī)格容器的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)均至少使用10支熱電偶進(jìn)行熱分布實(shí)驗(yàn)；
    (4)用待實(shí)驗(yàn)容器灌注粘度相類似的產(chǎn)品進(jìn)行熱穿透實(shí)驗(yàn)，找出容器中升溫最慢點(diǎn)的位置，至少使用10個(gè)容器，每個(gè)均加入適當(dāng)?shù)纳镏甘緞┎⑶也逵袩犭娕?。?dāng)滅菌釜的參數(shù)已經(jīng)達(dá)到熱分布實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)的可重現(xiàn)狀態(tài)，溫度達(dá)到設(shè)定的滅菌溫度時(shí)，開(kāi)始測(cè)定F₀  值，直到開(kāi)始冷卻止；
    (5)當(dāng)產(chǎn)品達(dá)到滅菌溫度直到開(kāi)始冷卻的過(guò)程，溫度變化必須保持在±0.5℃以內(nèi)。
 
2溫度驗(yàn)證的功能測(cè)試步驟
    由此技術(shù)設(shè)計(jì)要求出發(fā)，演化成為目前國(guó)內(nèi)廣泛采用的濕熱溫度驗(yàn)證的大容量注射劑實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)器具,也是溫度驗(yàn)證程序設(shè)計(jì)的基本要求。使用其作功能測(cè)試步驟及參考設(shè)備如下：
    前提： 濕熱滅菌設(shè)備的安裝測(cè)試合格，現(xiàn)場(chǎng)和公用工程外接條件完備。即通常講（DQ，IQ）已經(jīng)結(jié)束后，位置在OQ運(yùn)行確認(rèn)。
2.1熱分布測(cè)試  
    目的：找出最冷點(diǎn)位置，檢驗(yàn)重現(xiàn)性。步驟：(1)設(shè)備儀器校正；(2)熱電偶分布圖；(3)空載熱分布實(shí)驗(yàn)，3次以上；(4)熱電偶插入圖；(5)裝載（模擬生產(chǎn)裝載最大，最小量）熱分布實(shí)驗(yàn)，各3次以上。
2.2熱穿透測(cè)試 
    目的：肯定滅菌過(guò)程中被測(cè)試各點(diǎn)獲得無(wú)菌保證值，特別是最冷點(diǎn)位置的F₀ 值,監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)重現(xiàn)性。步驟：(1)設(shè)備校正；(2)模擬生產(chǎn)滅菌裝載；(3)熱電偶裝載圖；(4)同品同規(guī)產(chǎn)品最大與最小裝載熱穿透實(shí)驗(yàn)，每狀態(tài)3次以上。
2.3 生物指示劑測(cè)試
    目的： 挑戰(zhàn)性模擬生產(chǎn)可能因素造成的微生物污染程度來(lái)檢驗(yàn)滅菌可靠性，對(duì)驗(yàn)證設(shè)計(jì)進(jìn)行檢驗(yàn)。步驟：(1)方案的設(shè)計(jì)制定；(2)生物指示劑菌株的選擇，測(cè)定D值；(3)標(biāo)定濃度和制定樣品；(4)接種，裝載；(5)低限滅菌(每產(chǎn)品，每規(guī)格每種滅菌程序至少3次以上）；(6)樣品的培養(yǎng)與鑒別；(7)評(píng)價(jià)結(jié)論（數(shù)據(jù)，樣品分析）。
2.4 偏差與調(diào)整  
    重新設(shè)計(jì)后，重復(fù)上面步驟。
2.5 填寫驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)報(bào)告書(shū)           
3濕熱滅菌溫度驗(yàn)證對(duì)驗(yàn)證儀器的基本要求
    按前所述溫度驗(yàn)證程序設(shè)計(jì)要求的技術(shù)原則的五方面內(nèi)容，驗(yàn)證設(shè)備可包括三部分：(1)測(cè)溫元件；(2)測(cè)溫編輯記錄儀器；(3)輔助校正儀器。
3.1測(cè)溫元件
    測(cè)溫元件采用敏感的多枝精密鉑電阻或電偶組成，原理如圖1。接線較長(zhǎng)可以獨(dú)立的擺放在滅菌設(shè)備中選定位置，每支的誤差在±0.5℃以下的測(cè)試精度范圍。        
    校正時(shí)，發(fā)生誤差越程件應(yīng)篩選。這是因?yàn)檎`差越程后在后面的計(jì)算中將導(dǎo)致F₀ 偏離，容易帶來(lái)誤判結(jié)果。
    電偶是溫度到勢(shì)能的變換器，而電阻是溫度到阻值的變換器，兩者在輸出的信號(hào)上是不同的。從輸出特性靈敏度看精密鉑電阻（RTD）  為優(yōu)。從測(cè)溫范圍上比較（-180~2000℃），價(jià)性比上熱電偶較優(yōu)。
    所以，經(jīng)典教科書(shū)上和專家針對(duì)生產(chǎn)企業(yè)設(shè)備溫度驗(yàn)證仍推薦熱電偶。它是驗(yàn)證的溫度信號(hào)采集器（精密的多只眼睛）。目前開(kāi)發(fā)先進(jìn)的儀器采用無(wú)線信號(hào)傳送作為測(cè)溫元件。測(cè)溫記錄儀就近接收發(fā)來(lái)的每一個(gè)信號(hào)，自動(dòng)完成轉(zhuǎn)換和記錄、存儲(chǔ)，但造價(jià)昂貴，特別小氣，保管有特別的要求, 目前針對(duì)旋轉(zhuǎn)釜國(guó)內(nèi)已有使用。在滅菌釜的實(shí)際溫度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)儀器上，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)出成熟的部件和比較先進(jìn)的儀器，如GE.Kaye（US） 、raytek（US）、Sakura 、multi(Japen) 、Schlumbergez(England) 、  Goodwill(臺(tái)灣固緯)、Validator2000(北京祥鴻) 等溫度驗(yàn)證儀。
3.2測(cè)溫編輯記錄儀器
    測(cè)溫記錄儀器是整個(gè)實(shí)驗(yàn)的大腦。國(guó)內(nèi)外諸多公司直接采用PC機(jī)開(kāi)發(fā)，在Windows 系統(tǒng)平臺(tái)基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)自己的多點(diǎn)數(shù)據(jù)記錄、整理、計(jì)算、存儲(chǔ)及I/O的接口軟件，其集多功能軟件為一體裝配在計(jì)算機(jī)中，既便攜帶，又圖文齊備，直觀可靠。
3.3輔助校正儀器
    設(shè)計(jì)為一臺(tái)高精度的恒溫油槽（又稱干井，見(jiàn)圖2），采用溫控PID調(diào)節(jié)控溫精度高，溫度波動(dòng)范圍設(shè)計(jì)在±0.05℃。其有斷偶保護(hù)功能，上限設(shè)計(jì)超溫報(bào)警功能。升降溫快速、穩(wěn)定、可靠。在設(shè)定溫度和測(cè)量溫度數(shù)字上，分別3又1/2精確顯示。
    在低溫段檢校采取冰點(diǎn)槽（低溫干井）設(shè)施，高低溫干井分別檢測(cè)電偶的特殊點(diǎn)溫度值誤差和能否用于實(shí)驗(yàn)的合格性進(jìn)行甄別篩選。它即是本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)校正部件，也是實(shí)驗(yàn)室的常備精密溫度源。通常交國(guó)家法定技術(shù)監(jiān)督部門定期檢校確認(rèn)合格,在有效期內(nèi)使用。               
 
4電偶的布置及被滅菌物裝載
    從國(guó)內(nèi)許多溫度驗(yàn)證工作開(kāi)展與企業(yè)參觀的實(shí)踐中，專家都肯定被滅菌物裝載及電偶的布置對(duì)溫度驗(yàn)證結(jié)論有一定的影響。集中反映的問(wèn)題有以下幾方面：
    (1)電偶前端部分不要接觸周邊介質(zhì)（被滅菌裝載物，籠架，柜壁）。汽流和高溫水流對(duì)其沖擊不會(huì)發(fā)生碰撞接觸和位移；
    (2)釜（膽）體噴淋板孔堵塞或加工飛邊毛刺將影響水流及安置的設(shè)備平行度，也將影響水量分布和流向；
    (3)預(yù)測(cè)高溫點(diǎn)（蒸汽入口）、低溫點(diǎn)（凝結(jié)排放或循環(huán)水出口）與同步點(diǎn)（電偶位置與本柜設(shè)計(jì)檢測(cè)探頭處相同位置）的接線、編號(hào)與擺放方式有誤。
    裝載物（模擬滅菌生產(chǎn)類似物）的擺放模擬方式越接近實(shí)際生產(chǎn)，和影響熱傳遞的模擬產(chǎn)品的液體粘度越接近滅菌藥品粘度，擺放的電偶數(shù)量（10<N<20）越多越均勻，那么實(shí)驗(yàn)的可信度越大，真實(shí)誤差越小，越逼真。< DIV>
    在2.4(3)所涉及點(diǎn)外，其余點(diǎn)選擇視設(shè)備有所不同。如噴淋式滅菌柜，過(guò)熱水是由上至下流動(dòng)傳遞熱量，驗(yàn)證技師強(qiáng)調(diào)堆碼底層和堆碼中心是考核重點(diǎn)，建議擺放在底層均布為重；又如SVP脈動(dòng)滅菌釜，則強(qiáng)調(diào)堆碼底層接近排氣口周圍的布置是考核重點(diǎn)；再如噴淋旋轉(zhuǎn)式滅菌柜，過(guò)熱水是由外至里流動(dòng)傳遞熱量，驗(yàn)證技師強(qiáng)調(diào)中剖面四角和中心是考核重點(diǎn)，建議擺放呈軸向中部層為重。而某些專家特別研究后，提出仍以可靠性和準(zhǔn)確性為布置意圖的核心思想。然而，需要對(duì)不同釜形作具體分析和實(shí)驗(yàn)注重均布性，取弱點(diǎn)代表。
    值得注意的是在設(shè)定滅菌程序一定（如121 ℃/15分，115℃/35分等）后，溫度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證采取的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)，其裝載方式和生產(chǎn)滅菌的正常采用方式是相同的、固定的，否則會(huì)造成檢測(cè)偏差。特別強(qiáng)求的是，模擬生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)條件的相似性和一致性是相當(dāng)重要的條件因素。
    實(shí)際的LVP設(shè)備均為多籠車和大產(chǎn)量（有上萬(wàn)瓶/柜）的高效型。對(duì)冷點(diǎn)與次冷點(diǎn)的檢測(cè)和判斷必須是多次數(shù)據(jù)的綜合結(jié)論。然而，使用過(guò)程存在冷點(diǎn)、次冷的漂移和改變屬再驗(yàn)證確認(rèn)。
    高溫點(diǎn)的控制判斷也是必須監(jiān)測(cè)的參數(shù)，這將涉及到藥品的高溫藥效評(píng)價(jià)。探頭不足的情況下，可以固定裝載形式后，經(jīng)單籠車多次測(cè)試與對(duì)比，步步逼近搜尋冷點(diǎn)、次冷點(diǎn)、高溫點(diǎn)等參數(shù)。同時(shí)，應(yīng)和實(shí)際的生產(chǎn)裝載形式一致，不得改變裝載形式以保證應(yīng)用偏差的最小化和數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
    當(dāng)然，按照生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)的模擬情況步驟上應(yīng)有最小裝量和最大裝量，每品每規(guī)至少3次（如設(shè)備太大，探頭不夠而分段測(cè)試，則數(shù)據(jù)將更多），至少3組穩(wěn)定數(shù)據(jù)來(lái)考核設(shè)備的重現(xiàn)性和篩選熱分布參數(shù)的準(zhǔn)確性。
    加上校正、布置、輔助裝載、檢測(cè)、紀(jì)錄分析等是驗(yàn)證班技工好幾周的工作量。可見(jiàn)，試驗(yàn)的艱苦和細(xì)致要求，如此勞神費(fèi)力是因?yàn)樗臏?zhǔn)確性對(duì)后面工作有十分重要的指導(dǎo)性意義。
 
5熱穿透試驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間F₀
    熱量在物理學(xué)中有傳導(dǎo)、對(duì)流和輻射三種基本傳遞形式，其綜合產(chǎn)生了強(qiáng)大的熱穿透效果，人們關(guān)心的是熱穿透效果，故取名為熱穿透試驗(yàn)。早些書(shū)籍上有稱它為帶產(chǎn)品負(fù)荷的熱分布試驗(yàn)，目前仍然以熱穿透試驗(yàn)的稱謂居多。目的是為了用前述實(shí)驗(yàn)的極值點(diǎn)來(lái)考核其F₀值，對(duì)已經(jīng)滅菌的產(chǎn)品是否被賦予設(shè)計(jì)的滅菌保證值進(jìn)行具體數(shù)據(jù)檢測(cè)考核。
    本實(shí)驗(yàn)的步驟和方法與裝載和前述的熱分布試驗(yàn)大體相同，差別在于溫度探頭的布置是插在產(chǎn)品中，不接觸藥品容器周邊和底部。擺放在下列位置，并一一對(duì)應(yīng)作好編號(hào)：
    (1)熱分布試驗(yàn)確定的最冷點(diǎn)和次冷點(diǎn)；
    (2)熱分布試驗(yàn)確定的最熱點(diǎn)和次熱點(diǎn)；
    (3)和滅菌柜溫度控制設(shè)計(jì)探頭并列（又稱同步點(diǎn)）；
    (4)紀(jì)錄腔室溫度探頭（不插入產(chǎn)品中），其余和熱分布位置相當(dāng)，均勻布置。
    每點(diǎn)的溫度紀(jì)錄后按照時(shí)間間隔（30秒或1分）詳細(xì)紀(jì)錄打印，并計(jì)算每點(diǎn)從升溫到降溫過(guò)程中100℃上的F₀值、各點(diǎn)總的F₀均值、最大與最小值關(guān)鍵數(shù)據(jù)。
    探頭使用前后都要在冰點(diǎn)槽和油浴槽中仔細(xì)的校正，剔除超差件。在保證重現(xiàn)性非常好的情況下，穩(wěn)定試驗(yàn)數(shù)據(jù)不得低于3組。也就是本試驗(yàn)在某品種規(guī)格和對(duì)應(yīng)某裝載固定不變的工況下至少需穩(wěn)定狀態(tài)下作3次實(shí)驗(yàn)。可接受的標(biāo)準(zhǔn)是：
    (1)滅菌設(shè)計(jì)程序下各點(diǎn)熱穿透試驗(yàn)獲得的F₀值基本一致；
    (2)最冷點(diǎn)F₀值和產(chǎn)品的F₀  均值之間差值小于2.5(參數(shù)的參考解釋見(jiàn)《藥品生產(chǎn)驗(yàn)證指南》1996版，221)；
    (3)整體的F₀值監(jiān)察分析，其沒(méi)有在設(shè)計(jì)的F₀值允許波動(dòng)的公差上下限外數(shù)據(jù)；
    (4)具備良好的重現(xiàn)性，連續(xù)三次以上重現(xiàn)性）。
    以F₀值作為監(jiān)察分析的歷史由來(lái)已久，從經(jīng)典的資料查閱可以找到，濕熱滅菌中微生物殺滅的對(duì)數(shù)規(guī)則始于1921年Bigeow和Rahn等科學(xué)家的研究。他們論文的主要成果是：
    滅菌時(shí)微生物死亡遵循對(duì)數(shù)規(guī)則，過(guò)程可以用阿侖烏斯（Arrhenius）的一級(jí)反應(yīng)式來(lái)描述。根據(jù)質(zhì)量作用定律，在恒定溫度及保持其它條件不改變的情況下，單位時(shí)間內(nèi)被殺滅的微生物數(shù)正比于初始的原有數(shù)目，可以表示為以下的線性式：
    dN/dt = K (N_o-N _k ) …………(1)        
    整理后lg N _t = lg N_o – ( K/2.303) t
    取其斜率的負(fù)倒數(shù)定義為D值，D= 2.303/K= t/ (lg N_o - lg N _t )，取(lg N_o - lg N _t )=1，D= t， 則為微生物被殺滅90%的時(shí)間。也稱謂微生物九成殺滅時(shí)間,單位為分，D為正值。在USP中，D值則表示滅菌的程度。D值區(qū)分不同的微生物，在不同的溫度和介質(zhì)情況下數(shù)值不同，具體的數(shù)據(jù)是可以查閱的，其值越大表明微生物越難殺滅。
隨著滅菌溫度升高，殺滅耗用的時(shí)間越短。試驗(yàn)在（100~138℃）范圍lg D與溫度有線性關(guān)系，取其斜率的付倒數(shù)定義為Z值：
    Z  =  （T₂ – T₁ ）/ lgD ₁- lgD₂ ---------------（2）
    Z值代表微生物被殺滅減低一個(gè)lg D數(shù)量單位所需升高的溫度數(shù)值,代表微生物對(duì)熱敏感系數(shù)，其值越大對(duì)熱越不敏感。單位為℃ ，Z 為正值。實(shí)驗(yàn)選取強(qiáng)耐熱菌株（嗜熱脂肪桿菌B.Stearothermophilus）為代表的Z值在多種介質(zhì)中為9.4 ，考慮Z值選取10，從安全角度既留有安全余地且對(duì)數(shù)計(jì)算應(yīng)用上十分簡(jiǎn)便。
    D₂ / D ₁  =  10 ^{(T1 – T2) / Z}    帶入測(cè)試時(shí)間間隔Δt和效果時(shí)間多項(xiàng)累計(jì)求和,將T2設(shè)為參比溫度T0，在變溫情況下的滅菌等效式求F值計(jì)算整理，F(xiàn)值的數(shù)學(xué)表達(dá)式是一個(gè)多項(xiàng)和結(jié)果，也有直接以積分形式寫出的代表式。數(shù)學(xué)多項(xiàng)表達(dá)式對(duì)物理特性表達(dá)較為直觀： 
   
    Δt 為測(cè)量被滅菌物溫度的時(shí)間間隔（一般采用1分或0.5分），分為單位；
    T為每個(gè)Δt時(shí)間間隔測(cè)得的被滅菌物溫度值，℃為單位；
    T_0­是參比溫度值，℃為單位；
    Z為微生物數(shù)降低一個(gè)對(duì)數(shù)lgD值所需要升高的溫度數(shù)，℃為單位；
    F ，分為單位。
    它的物理含義是在變溫條件下t分鐘滅菌效果與溫度T_0­ （參比溫度）時(shí)F分鐘的滅菌效果相同等效。這是很有意義和具有非常適用價(jià)值的表達(dá)式，因?yàn)楣I(yè)生產(chǎn)滅菌是不可能在一瞬間完成，長(zhǎng)時(shí)間溫度恒定不變的絕對(duì)理想狀態(tài)也是不存在的，因而在實(shí)際的生產(chǎn)操作中將廣泛涉及該式。
    當(dāng)Z值取10℃時(shí)，這個(gè)數(shù)學(xué)表達(dá)式就剩下實(shí)測(cè)溫度T和間隔時(shí)間Δt兩個(gè)變量，代表各個(gè)溫度值下的滅菌效果轉(zhuǎn)化為121 ℃標(biāo)準(zhǔn)溫度下Z值10℃下的滅菌時(shí)間效果，并記為F₀值
   
    上式直接由溫度T和時(shí)間Δt兩個(gè)物理量決定，某些書(shū)籍又稱物理F₀  （標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間）。物理F₀目前僅限于濕熱滅菌，在試驗(yàn)中需要注意不能與干熱、輻射等滅菌標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)相混淆。
    它包括滅菌過(guò)程的升、保、降溫過(guò)程三皆段熱能對(duì)微生物總致死量效果，其是以時(shí)間為單位表示在滅菌溫度121℃時(shí)等效的量值（以時(shí)間的量值來(lái)表示的代用值）。
    F₀代用值能代表無(wú)菌嗎？以  F₀≥8為題展開(kāi)，牽扯到一個(gè)容易和無(wú)菌概念混淆問(wèn)題，在1995年前世界上許多從事無(wú)菌和滅菌產(chǎn)品的人們把F₀≥8視為（當(dāng)成）產(chǎn)品滅菌標(biāo)準(zhǔn)，好像F₀≥8就等同達(dá)到產(chǎn)品無(wú)菌要求，而忽視其具體工藝污染控制手段問(wèn)題。這是不對(duì)的，這對(duì)無(wú)菌要求在概念上屬認(rèn)識(shí)性的錯(cuò)誤。
    F是指特定控制情況下被滅菌產(chǎn)品被污染的概率低于某值概念，賦予了產(chǎn)品一定的安全性而言，其是在制造過(guò)程（工藝）其他的染菌因素必須嚴(yán)格控制的特定情況下的。F₀≥8在本設(shè)計(jì)程序下能殺滅到何種程度？是針對(duì)不同的產(chǎn)品和帶有不同染菌數(shù)而設(shè)計(jì)的。不同染菌數(shù)樣本可以在F₀≥8狀況下滅菌結(jié)束采取驗(yàn)算確認(rèn)殘存數(shù)或者輔之采樣培養(yǎng)予以確認(rèn)。在微生物失控情況下，根本不能稱無(wú)菌。由此可見(jiàn)：
    沒(méi)有嚴(yán)格的工藝制造過(guò)程染菌控制，即使F₀≥8 也不能達(dá)到無(wú)菌要求，反之一樣。所以，USP23（1211）不再提出將F₀≥8即符合無(wú)菌要求的條款寫入。因而，此概念也不能簡(jiǎn)單套用到其他無(wú)菌概念，也不能講F₀ 達(dá)到多少后就達(dá)到無(wú)菌要求，這本不是同一概念。
    當(dāng)然，在設(shè)計(jì)滅菌程序參數(shù)時(shí)應(yīng)充分考慮增大被滅菌物的安全性，一般放大F₀需作多次謹(jǐn)慎驗(yàn)證試驗(yàn)后才遞出工藝修正報(bào)告。不能輕易放大F₀，因?yàn)樗撬且话央p刃劍，過(guò)度（過(guò)熱）滅菌后果對(duì)藥品來(lái)說(shuō)很容易藥效報(bào)廢，并析出難以控制的雜質(zhì)或（毒）副產(chǎn)物，毀壞藥品質(zhì)量，而造成一系列精心操作過(guò)程的前功盡棄，過(guò)度滅菌產(chǎn)品同樣對(duì)病員無(wú)益。
    現(xiàn)在回頭檢查熱穿透多次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。如已經(jīng)達(dá)到可接受的標(biāo)準(zhǔn)了，則表明在滅菌柜最冷點(diǎn)（次冷點(diǎn)）以及最高溫點(diǎn)（次高溫點(diǎn)）的達(dá)到設(shè)計(jì)要求，極限點(diǎn)的數(shù)據(jù)表明滅菌是在設(shè)計(jì)操作程序可控制范圍。既可保證腔內(nèi)藥品被賦予設(shè)計(jì)的足夠安全性，又不在影響藥效的過(guò)度滅菌溫度范圍。同時(shí)，同步點(diǎn)檢測(cè)合格意味設(shè)備本身儀表反映的參數(shù)也是真實(shí)可靠，設(shè)備設(shè)計(jì)、制造與安裝調(diào)試是合格的。這樣為設(shè)備驗(yàn)證合格奠定了很好的基礎(chǔ)，也為產(chǎn)品滅菌質(zhì)量保證鎖上了"第一把鎖"。
 
6生物指示劑試驗(yàn)（也稱為挑戰(zhàn)性試驗(yàn)）
   涉及濕熱滅菌的生物指示劑試驗(yàn)指將一定量的已知D值微生物耐熱孢子接種到待滅菌的產(chǎn)品中，在設(shè)定的滅菌程序條件下限滅菌，以驗(yàn)證設(shè)定的滅菌工藝程序是否確實(shí)賦予產(chǎn)品所設(shè)定的F₀值，由此進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)和評(píng)價(jià)過(guò)程也稱為挑戰(zhàn)性試驗(yàn)。操作步驟如下：
6.1驗(yàn)證方案制定的重點(diǎn)在產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性、產(chǎn)品的污染水平與污染菌的耐熱數(shù)據(jù)。
    (1)產(chǎn)品分析（接種模擬污染水平≥生產(chǎn)污染水平）；
    (2)確定菌種孢子，選擇強(qiáng)于產(chǎn)品常見(jiàn)污染菌的熱耐受菌種孢子（菌種孢子含量的準(zhǔn)確性，質(zhì)量資料具備可追溯性，在有效期內(nèi)）；
    (3)選取非致病菌，且具有良好的重現(xiàn)性能；
    (4)應(yīng)在接種同時(shí)留置多支陽(yáng)性對(duì)照品，試驗(yàn)過(guò)程同步采樣培養(yǎng)。
6.2充分采用熱分布及熱穿透的工作數(shù)據(jù)。
    裝載和樣品按照熱穿透布置不變。特別關(guān)注滅菌釜的最冷點(diǎn)、次冷點(diǎn)以及同步點(diǎn)樣品編號(hào)。
6.3設(shè)置試驗(yàn)溫度滅菌限（也稱低限滅菌）
    既低于設(shè)計(jì)值，比F₀ 低3 %~5%進(jìn)行滅菌。由此而設(shè)計(jì)滅菌程序時(shí)間，如滅菌值F₀ 產(chǎn)品計(jì)算下限為8.5，設(shè)計(jì)為8.3限。
6.4按擬訂下限滅菌程序結(jié)束
    (1)QC現(xiàn)場(chǎng)采樣，試驗(yàn)編號(hào)數(shù)據(jù)和對(duì)照品編號(hào)數(shù)據(jù)同步收集；
    (2)樣品按照確定菌種孢子培養(yǎng)要求（一般在特定溫度和有好氧與厭氧條件區(qū)分）；
    (3)實(shí)驗(yàn)樣品和陽(yáng)性品同條件分別培養(yǎng)觀測(cè)。如陽(yáng)性品正常培養(yǎng)失敗，既可判試驗(yàn)無(wú)效而失敗。因盾之不存，矛的鋒利無(wú)從談起。 
6.5為檢測(cè)試驗(yàn)的重現(xiàn)性
    每一品種規(guī)格的滅菌程序至少應(yīng)進(jìn)行3次以上的試驗(yàn)，試驗(yàn)的數(shù)據(jù)必須穩(wěn)定一致，重現(xiàn)性良好。否則，查找原因，重新開(kāi)始。
    生物指示劑挑戰(zhàn)性試驗(yàn)是一項(xiàng)典型的滅菌安全性評(píng)價(jià)驗(yàn)證，需要工藝人員試驗(yàn)技師和QC方面密切的配合和精確的設(shè)計(jì)。達(dá)到2.6.4與2.6.5可接受的標(biāo)準(zhǔn)后，可以證實(shí)試驗(yàn)成功，它代表工藝設(shè)計(jì)的滅菌程序與參數(shù)是合理的，也賦予了產(chǎn)品足夠的安全性。另一方面，也證實(shí)前期設(shè)備的選擇是符合生產(chǎn)需要的硬件。
    操作擬訂的SOP、SMP把生產(chǎn)技術(shù)操作過(guò)程置于可控范圍，至此本項(xiàng)驗(yàn)證工作可以告結(jié)束，轉(zhuǎn)入下一項(xiàng)定期再驗(yàn)證流程。這樣，為將來(lái)產(chǎn)品滅菌質(zhì)量保證鎖上了"第二把鎖" 。
 
實(shí)例2
 
2.滅菌柜的驗(yàn)證
2.1評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和驗(yàn)證內(nèi)容
    在1992年版世界衛(wèi)生組織的《規(guī)范》第17章，提到對(duì)注射劑的驗(yàn)證要求：
    (1)17.32條：所有設(shè)備如滅菌柜、空氣過(guò)濾系統(tǒng)、水處理系統(tǒng)（包括蒸餾水機(jī)）均應(yīng)按計(jì)劃進(jìn)行驗(yàn)證、維護(hù)和監(jiān)控。
    (2)17.55條：任何滅菌方法在正式采用前，該方法對(duì)產(chǎn)品的適用性以及每一裝載方式下被滅菌品的所有部位是否達(dá)到規(guī)定滅菌要求都應(yīng)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。應(yīng)定期進(jìn)行再驗(yàn)證，每當(dāng)設(shè)備有重大改變時(shí)，也須進(jìn)行再驗(yàn)證。
    而在98版《藥品GMP檢查指南》中：
    (1)3102條：滅菌柜的能力是否與生產(chǎn)相適應(yīng)，是否具有自動(dòng)監(jiān)測(cè)及記錄裝置。
    (2)*5703條：關(guān)鍵設(shè)備及無(wú)菌藥品的驗(yàn)證內(nèi)容是否包括滅菌設(shè)備、藥液濾過(guò)及灌裝（分裝）系統(tǒng)。
    由上可見(jiàn)，滅菌工序?qū)τ谧⑸鋭┥a(chǎn)的重要作用以及藥政部門對(duì)滅菌柜驗(yàn)證的重視。而對(duì)于滅菌柜的驗(yàn)證，美國(guó)FDA和歐盟藥品衛(wèi)生組織對(duì)于不同的滅菌柜有具體的指引和要求（可以查閱有關(guān)的官方網(wǎng)頁(yè)），我國(guó)在這方面只有02年版的《藥品驗(yàn)證指南》大容量注射劑章節(jié)中給出對(duì)于滅菌柜驗(yàn)證的例子，同時(shí)05版的《藥典》中關(guān)于滅菌法部分也給出更詳細(xì)的要求。我們大多是參照它來(lái)制定評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的，筆者參考指南的例子把整個(gè)滅菌柜驗(yàn)證簡(jiǎn)單歸納為以下幾個(gè)方面：
    (1)預(yù)確認(rèn)，對(duì)滅菌柜的基本功能是否達(dá)到公司的要求進(jìn)行確認(rèn)；
    (2)安裝確認(rèn)，包括文件確認(rèn)、圖紙檢查、主要機(jī)械部件檢查、安全系統(tǒng)檢查、公用管道連接檢查、儀器儀表檢查和校正、控制系統(tǒng)硬件部分檢查、控制系統(tǒng)軟件功能實(shí)現(xiàn)檢查、備件備品的檢查等；
    (3)運(yùn)行確認(rèn)，包括功能測(cè)試和基本性能參數(shù)的確認(rèn)，以及對(duì)上述安裝確認(rèn)內(nèi)容的運(yùn)行時(shí)動(dòng)態(tài)確認(rèn)，同時(shí)根據(jù)實(shí)際情況修訂操作規(guī)程和對(duì)操作人員進(jìn)行實(shí)操培訓(xùn)；
    (4)性能確認(rèn)，包括驗(yàn)證儀器的校驗(yàn)、空載熱分布(腔室平均溫度與冷點(diǎn)溫差小于1.5℃)、滿載熱分布(腔室平均溫度與冷點(diǎn)溫差小于1.5℃)、滿載熱穿透的試驗(yàn)以及生物指示劑的挑戰(zhàn)性試驗(yàn)。其中，主要的衡量標(biāo)準(zhǔn)是滅菌階段冷點(diǎn)和平均溫度之差小于0.5℃和最終F₀值大于8。
 
2.2滅菌柜驗(yàn)證操作過(guò)程
    關(guān)于預(yù)確認(rèn)和安裝與運(yùn)行確認(rèn)的內(nèi)容在此省略，因?yàn)檫@和其他制藥設(shè)備驗(yàn)證的基本準(zhǔn)則是一樣的。另需注意的是關(guān)于滅菌柜的安全部分和控制部分的確認(rèn)，因?yàn)闇缇袷菈毫θ萜?，安全防護(hù)的措施和設(shè)置是必不可少的，這些措施既有機(jī)械方面的也應(yīng)該有電器和PLC程序方面的，而滅菌效果如何則取決于控制程序和探頭的精度等因素，所以要把握重點(diǎn)。在完成了以上的三種確認(rèn)以后，就進(jìn)入性能確認(rèn)。
    (1)驗(yàn)證用的儀器，主要由三部分組成：高精度的測(cè)溫探頭（進(jìn)口PT100熱電阻溫度探頭）、用微機(jī)制成的測(cè)溫和傳送集成系統(tǒng)以及手提電腦（主要是電腦上用VB編寫的和數(shù)據(jù)庫(kù)連接的驗(yàn)證儀記錄軟件）。
    (2)使用以前當(dāng)然就是要進(jìn)行校正。
    (3)校正完了以后就按照布點(diǎn)圖進(jìn)行布點(diǎn)。1)空載熱分布是指柜內(nèi)不放任何玻璃瓶，只放空的滅菌架進(jìn)入腔體；2)滿載熱分布是指按最大裝載量把玻璃瓶放滿滅菌架中，然后探頭是放于瓶外去測(cè)溫，看瓶外的溫度變化；3)滿載熱穿透的玻璃瓶放置方法和跟滿載熱分布一樣，只是溫度檢測(cè)探頭的位置不一樣，滿載熱穿透是把探頭放置于盛滿藥液或水的瓶子中緊固，用于探測(cè)瓶?jī)?nèi)溫度。
    以上每個(gè)階段都需要進(jìn)行至少連續(xù)運(yùn)行3次。這里需要注意的是不同的規(guī)格都需要按最大裝載量去放置，而且要按正常滅菌的程序進(jìn)行滅菌，不然就失去驗(yàn)證的意義了（當(dāng)然也可以進(jìn)行挑戰(zhàn)性試驗(yàn)，適當(dāng)降低滅菌溫度，這里不作詳述），而我們?cè)谶@個(gè)過(guò)程只需要觀察數(shù)據(jù)就可以了。
    還有用生物指示劑進(jìn)行挑戰(zhàn)性試驗(yàn)，生物指示劑的選用可根據(jù)藥典，但應(yīng)強(qiáng)調(diào)所用生物指示劑的耐熱性應(yīng)大于產(chǎn)品中常見(jiàn)污染菌的耐熱性，用量也應(yīng)大于產(chǎn)品中該污染菌的水平，經(jīng)生物指示劑驗(yàn)證后，應(yīng)能證明在設(shè)定的F₀值條件下，產(chǎn)品的無(wú)菌保證水平低于10^－6。
    (4)最后驗(yàn)證完要對(duì)溫度探頭進(jìn)行再次校正，驗(yàn)證前后偏差均應(yīng)小于0.5℃為合格。
 
2.3滅菌柜驗(yàn)證數(shù)據(jù)分析
    驗(yàn)證過(guò)程做完了，輪到最關(guān)心的數(shù)據(jù)分析階段，有很多人只關(guān)心結(jié)論是否合格？可以生產(chǎn)了嗎？其實(shí)這是錯(cuò)誤的，驗(yàn)證的核心思想是通過(guò)驗(yàn)證過(guò)程發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，了解滅菌柜的實(shí)際工作狀況（特別是每年的再驗(yàn)證更是如此），從而解決問(wèn)題，為日后的維護(hù)和檢查提供依據(jù)與對(duì)照，才能知曉這個(gè)柜控制是否合理、精度如何、是否年久失修等，有經(jīng)驗(yàn)的人就能通過(guò)對(duì)比數(shù)據(jù)就能看出來(lái)，讓滅菌柜更穩(wěn)定地工作才是驗(yàn)證目的。
    水浴式非旋轉(zhuǎn)的滅菌柜溫度分布特點(diǎn)是怎樣的呢？總的來(lái)說(shuō)，柜底近排水位置會(huì)相對(duì)低一些，至于哪一邊溫度低些則可能取決于滅菌柜的安裝水平度或者由于噴淋頭的堵塞狀況，而柜的中間位置溫度會(huì)相對(duì)溫度高一些。(圖3)是一個(gè)非旋轉(zhuǎn)水浴式滅菌柜滿載熱穿透滅菌過(guò)程的溫度曲線圖，從上圖可以看出非旋轉(zhuǎn)水浴式滅菌柜柜內(nèi)各點(diǎn)的熱分布還是比較均勻的，比蒸汽式滅菌柜要好很多，但又比旋轉(zhuǎn)水浴式滅菌柜要差一些，也許這就是非旋轉(zhuǎn)水浴式滅菌柜成為主流滅菌柜的原因吧。